小金丸为清代王洪绪《外科证治全生集》收载的经典名方，由人工麝香、乳香（制）、没药（制）、五灵脂（醋炒）、地龙、制草乌、枫香脂、木鳖子（去壳去油）、当归（酒炒）及京墨10味药材制成，具有活血化瘀、散结消肿止痛等功效，主要用于治疗痰气郁结所致的乳癖、乳岩等病症，是目前临床治疗乳腺疾病的首选中成药[1-2]。小金丸组方复杂，药味组成特殊，包含贵细药、树脂树胶类药物、动物药、粪便类药物、植物药、矿物药；不少药物缺乏有效的质控标准，质量参差不齐。此外，这些药物的质地、比重、黏性、油性、粉碎规律等性质差异较大，使得制备工艺中的混合均一性差，导致小金丸质量可控性差。
质量控制是制约中药现代化发展的重要瓶颈问题[3-4]。其中，很重要的内容就是保证产品的质量一致性。药品质量一致性是确保临床疗效稳定可靠、基础与临床试验结果可重复的重要前提[5-6]。对于中成药而言，原料药质量的一致性与生产工艺的可控性是确保中成药品质一致性的关键[7-8]。
目前，对于中成药质量一致性评价方法已有诸多探索，具体包括指标成分的定量测定、近红外光谱法、拉曼光谱法、颜色气味的客观评价以及生物评价方法等[9-14]。这些方法从不同角度为质量一致性的评价提供了参考标准[15]。结合小金丸的复杂情况，仅从单酯型生物碱量、阿魏酸量等方面评价市售小金丸混合均匀性，所选指标较少，尚不能对其作出全面充分的评价[16-17]。当下，液质联用分析技术发展迅速，反应灵敏，响应值高，分析速度快，大大拓宽了待检成分的检测限（LOD）与定量限（LOQ），扩大了可用于一致性评价的化学活性成分选择范围；结合化学计量学的分析方法，有利于对数据进行充分地挖掘，实现全面、快速、准确评价中成药一致性[18-19]。基于此，本实验建立了HPLC-MS/MS法对小金丸中活血药当归中藁本内酯，活血化瘀药五灵脂中原儿茶酸，通络药地龙中肌苷，散结消肿药木鳖子中齐墩果酸，制草乌中毒性药效成分苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱10种成分的量同时进行研究。比较了不同厂家、不同批次小金丸活性成分量差异，以期为小金丸的质量控制提供科学依据，为药企投料提供合理建议，也为其他类别中成药一致性评价提供新的思路。
1仪器与试药
Agilent高效液相色谱仪，配有在线脱气机，四元泵，自动进样器，美国Agilent公司；AgilentC三重串联四极杆液质联用仪，配有ESI离子源，美国Agilent公司；BPDAG型电子分析天平，德国Satorius公司；KQ-DA型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
对照品新乌头碱（mesaconitine，MA，批号-）、乌头碱（aconitine，AC，批号-）、次乌头碱（hypaconitine，HA，批号-）、苯甲酰新乌头原碱（benzoylmesaconitine，BMA，批号-）、苯甲酰乌头原碱（benzoylaconitine，BAC，批号-）、苯甲酰次乌头原碱（benzoylhypaconitine，BHA，批号-）购于中国食品药品检定研究院。肌苷（creatinine，Cr，批号为）购于成都植标化纯有限公司；齐墩果酸（oleanolicacid，OA，批号）、原儿茶酸（protocatechuicacid，PA，批号）、藁本内酯（ligustilide，Lig，批号）购于成都普瑞法科技开发有限公司。以上对照品质量分数均≥98%。乙腈为色谱纯，ThermoFisherScientific公司；甲酸为色谱纯，购于成都市科隆化工试剂厂，批号为；水为蒸馏水，购于屈臣氏，批号为C。收集共8个厂家（A～H）23个批次市售小金丸，其样品编号及批次见表1。
2方法与结果
2.1色谱条件
AgilentTechnologiesZorbaxEclipseXDB-C18色谱柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～1min，2%～20%乙腈；1～5min，20%～50%乙腈；5～10min，50%～75%乙腈；10～15min，75%～%乙腈；15～30min，%～2%乙腈；体积流量为0.45mL/min；进样前按初始流动相条件平衡10min；柱温30℃；进样量5μL。
2.2质谱条件
离子源为ESI源，正离子模式；脱溶剂温度℃；脱溶剂气N2体积流量11L/min；雾化器压力.kPa（15psi）；毛细管电压V；扫描方式为多反应监测（MRM）；用于定量分析的检测离子对如表2所示。此条件下，各化合物的MRM色谱图见图1。
2.3对照品溶液的制备
分别取各对照品适量，精密称定，用色谱甲醇配制成含Lig99.8μg/mL、PA.0μg/mL、Cr.0μg/mL、OA.0μg/mL、BMA.0μg/mL、BHA.7μg/mL、BAC.0μg/mL、MA.0μg/mL、HA97.0μg/mL、AC.0μg/mL的对照品储备液。
2.4供试品溶液的制备
分别将各批次小金丸粉碎，过40目筛，各精密称定0.3g粉末，置具塞离心管中，精密加入色谱甲醇5mL，称定质量。超声（功率W，频率80kHz）提取30min，放冷后再次称定质量，用色谱甲醇补足减轻的质量，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
2.5方法学验证
2.5.1线性关系考察及LOD和LOQ测定取对照品储备液适量，用色谱甲醇稀释为系列溶液，得到不同质量浓度梯度的对照品溶液，在拟定的HPLC-MS/MS条件下测定。以待测物的质量浓度为横坐标（X），待测物的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（r）。同时测定各待测物的定量限（以信噪比S/N＝10确定）和检测限（以信噪比S/N＝3确定）。结果见表3。
2.5.2精密度试验将“2.3”项下配制的对照品储备液稀释10倍，按上述检测条件进行分析，连续进样6针，记录各化合物峰面积，计算其RSD值。结果见表4，10种化合物峰面积RSD均在0.%～3.%，表明该方法精密度良好。
2.5.3稳定性试验精密称定E厂家批号为20141的小金丸样品粉末约0.3g制备供试品溶液，室温放置，分别于0、4、8、12、16、24h进行HPLC-MS/MS分析，计算10种待测成分峰面积的RSD，结果见表4，其RSD均在0.%～4.%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.5.4重复性试验取E厂家，批号为20901的小金丸样品粉末约0.3g，平行6份，精密称定，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC-MS/MS分析，根据所建立的标准曲线计算待测物质量分数及RSD，结果见表4。10种待测成分质量分数RSD均小于4.56%，表明该方法重复性良好。
2.5.5加样回收率试验取A厂家，批号为的小金丸粉末约0.15g，共6份，精密称定，置于10mL具塞离心管中，分别加入相当于该批次小金丸中各成分量的各对照品溶液，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC-MS/MS分析，计算各待测物的平均回收率及RSD，结果见表4。10种待测物的加样回收率在94.81%～.33%，RSD在1.%～4.%，表明该方法的准确度良好。
2.6样品定量测定
取所收集的23批市售小金丸，分别取粉末约0.3g，精密称定。按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，进行HPLC-MS/MS分析，根据所建立的标准曲线计算各样品中待测成分的质量分数，结果见表5。
2.7聚类分析
用SPSSStatistics21分析软件对不同厂家、不同批次小金丸定量测定结果进行系统聚类分析，结果如图2所示。可以看出A1、A2、A3、A4、A5、A6与C2及其他厂家、其他批次的小金丸差异较大，且A厂家各批次之间也有一定差异。而B厂家小金丸各批次间差异性较其他厂家小，同时，B、C、D、E、F、G、H厂家之间的小金丸质量差异性与A厂家相比较小。
2.8PCA
由于10种成分在不同厂家、不同批次小金丸中的量不同，趋势也不一致。因此，采用PCA法对数据进行降维处理[20]，并观察23个批次小金丸样品的自然分组。对不同厂家、不同批次23份小金丸样品的进行PCA建模。由图3-A、B可看出，23个批次小金丸可分为2类。从不同批次小金丸散点分布可以看出，A厂家小金丸为一类，其他厂家小金丸为一类。从载荷图与得分图的对应关系来看，A厂家中MA、AC量最高，BAC、Lig、Cr、OA量也较其他厂家高。其他部分厂家中HA、BHA、BMA量较高。从载荷图可看出BMA、BHA、AC、Cr等组分离原点距离最远，对不同批次小金丸的分类起主要作用[21-22]，市售小金丸中此类成分量差别较大，要提高不同厂家、不同批次小金丸的质量一致性，需重点控制此类成分的量。其中BMA、BHA、AC来自方中温经散寒药制草乌，Cr来自通络药地龙。
制草乌为方中君药，用量较大，有毒，具有祛风湿、温经止痛的功能。现代研究表明，其所含双酯型生物碱与单酯型生物碱是制草乌抗炎、镇痛的主要活性成分，同时，双酯型生物碱具有较强的毒性，可引起心律失常、心动过速或呼吸麻痹[23]。因此，在小金丸中对双酯型生物碱、单酯型生物碱的质量控制很有必要。地龙活血通络，可使寒散络通、痰消瘀化。现代研究表明，地龙具有较好的抗凝血、抗肿瘤、解热镇痛、抗炎作用，同时含有生长因子，具有促进组织修复的作用[24]。制草乌治疗剂量与中毒剂量较为接近，若炮制不当，可能会引起神经、胃肠道、心血管等多系统的损害，给部分患者带来严重的不良反应。地龙质量控制不当，会降低小金丸治疗效果或带来毒副反应。要控制此类活性成分量，各生产厂家必须从生产源头控制制草乌和地龙质量，严格执行制草乌的相关质量标准，控制制草乌和地龙投料量，以降低市售小金丸的毒副作用，提高其疗效和质量均一性。
3讨论
本实验采用HPLC-MS/MS法对不同厂家、不同批次共计23批小金丸中10个活性成分进行定量测定。在流动相的选择上，本实验对乙腈、甲醇、不同体积分数甲酸水溶液进行比较，最终结果表明，以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱时，10种待测成分具有很高的响应值，且能够得到较好峰型。在提取条件的选择上，实验比较了不同浓度的甲醇、乙醇溶液以及时间对提取效果的综合影响，最终确定以纯甲醇溶液，超声提取30min为宜。
中成药质量主要由其中活性成分量决定，绝大多数中成药由多个厂家同时生产，其质量参差不齐，疗效差异较大，甚至出现诸多副作用，给临床用药带来严峻挑战。因此不同厂家药品的一致性评价显得尤为重要。本实验首次建立了一种全面、快速、灵敏度高的HPLC-MS/MS分析方法，用于同时测定市售小金丸中Lig、PA、Cr、OA、BMA、BHA、BAC、MA、HA、AC10种活性成分量，为小金丸的质量控制提供了有效的分析手段及科学依据，为药企投料提供合理建议。
借助聚类分析和PCA对定量测定结果进行评价，结果表明不同厂家、不同批次小金丸在一些重要化合物的量上存在差异，发现了苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头碱、肌苷等活性成分是区分各批次小金丸的关键活性成分，揭示了市售小金丸质量差异的客观性。23个批次小金丸中乌头碱类成分和肌苷量差异较大，提示各厂家在投料时，要严格把控制草乌和地龙饮片的质量，切实执行相关质量标准，从生产源头进行药品质量控制；在生产阶段可重点对此类含量差异较大的成分进行动态监测，实时控制药品质量均一性；对于小金丸成品，可增加对此类成分的检测，以客观评估成药质量均一性。因此，厂家可从原料-生产-成药3个阶段，高效地、有针对性地对小金丸质量一致性进行控制与评价。从源头、生产过程和成品进行乌头碱类成分和肌苷量监测，能更加客观地评价与提高市售小金丸质量的均一性、保证临床疗效、降低毒副作用。该分析方法对于探讨中成药质量差异性原因具有重要意义，为药企进一步提升药品质量提供建议，为其他类别中成药一致性评价提供新的思路与方法。
志谢：四川大学邹文铨教授对本研究给予指导！
参考文献（略）
此文摘自：熊茜，潘媛，张婷，杨明，谭庆刍，许润春，张定堃，韩丽.HPLC-MS/MS多组分定量测定结合化学计量学研究市售小金丸的质量一致性[J].中草药,,48(11):-.
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