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摘要：目的旨在建立基于体外抗血小板聚集的小金丸生物效价检测方法，评价其质量一致性，筛选小金丸组方中发挥活血作用的中药。方法小金丸及其组方中的10味中药（人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙、京墨）40%甲醇超声提取，以提取物为供试品通过血小板聚集仪测定其抗血小板聚集率。大鼠腹主动脉取血，制备富血小板血浆（PRP）和乏血小板血浆（PPP），用二磷酸腺苷（ADP）诱导血小板聚集，以阿魏酸钠作为标准对照物质，根据简化概念单位法计算小金丸的抗血小板聚集生物效价。结果不同厂家、不同批次间小金丸的抗血小板聚集生物效价在0.～1.U/mg。小金丸组方中地龙、五灵脂和木鳖子抑制血小板聚集作用较强，抑制率分别为70.87%、31.83%、67.52%。结论不同厂家、不同批次小金丸质量一致性较差，地龙、五灵脂和木鳖子可能是小金丸组方中发挥活血作用的关键中药。
小金丸，又名“小金丹”，为清代医家王洪绪《外科证治全生集》收载的经典名方，由麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙、京墨共10味药组成，具有活血化瘀、散结消肿止痛等功效，主要用于治疗痰气郁结所致的乳癖、乳岩等病症，是当前临床治疗乳腺增生的首选中成药[1-3]。
小金丸组方复杂，药味组成特殊，包含贵细药、树脂树胶类药物、动物药、粪便类药物、植物药和矿物药，加之制备工艺中的混合均一性差，导致小金丸质量可控性差[4]。目前，小金丸的品质评价方法大多依靠化学成分理化分析手段[5-7]，但小金丸成分众多，药效物质基础不明确，仅用化学检测手段评价其质量一致性存在一定的弊端，难以直接关联其活血的临床疗效。
生物评价是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物生物活性的一种方法，具有药效相关、整体可控等优点，符合中医药特点的质量标准控制模式及方法，已成为中药质量评控的重要发展方向[8-9]。活血化瘀是小金丸临床主要功效之一，组方中包含传统活血类中药麝香、乳香、没药、当归和枫香脂，以及现代研究发现的具有活血药理作用的中药五灵脂和地龙。因此，本实验以小金丸临床活血化瘀疗效作为质量评价的出发点，建立体外抗血小板聚集活性的生物评价方法，比较不同厂家、不同批次小金丸的抗血小板聚集效价，以期补充和完善小金丸现有的质量评价体系，为小金丸的质量控制提供科学建议。
1仪器与材料
1.1仪器
AggRMA血小板聚集分析仪，美国Helena公司；XL5A多管架自动平衡离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；SKH超声仪，53kHz，上海科导超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Sdenz-F冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2动物与试剂
雄性SD大鼠，60只，SPF级，体质量～g，动物许可证号SCXK-（湘）-，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。戊巴比妥钠，批号，质量分数98%，Sigma公司；二磷酸腺苷（ADP），批号E，北京索莱宝科技有限公司；阿魏酸钠，批号S，质量分数＞98.0%，上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）和甲醇均为分析纯，水为超纯水。
1.3小金丸样品及处方原料药物
本研究共收集共9个厂家［A～I分别代表厂家成都九芝堂金鼎药业有限公司、九寨沟天然药业集团有限责任公司、成都永康制药有限公司、西安自力中药集团有限公司、华润三九（黄石）药业有限公司、吉林省天光药业有限公司、南京同仁堂药业有限责任公司、北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂和四川凯京制药有限公司］30个批次市售小金丸，其样品编号及批次见表1。人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙和京墨均由成都九芝堂金鼎药业有限公司提供。经成都中医药大学药学院许润春副教授鉴定，木鳖子为萌芦科植物木鳖Momordicacochinchinensis(Lour.)Spreng.的干燥成熟种子；制草乌为毛茛科植物北乌头AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥块根；枫香脂为金缕梅科植物枫香树LiquidambarformosanaHance的干燥树脂；乳香为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.树皮渗出的树脂；没药为橄榄科植物地丁树CommiphoramyrrhaEngl.的干燥树脂；五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠TrogopterusxanthipesMilne-Edwars的干燥粪便；当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根；地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)的干燥体。
2方法
2.1小金丸抗血小板聚集效价测定
2.1.1富血小板血浆和乏血小板血浆的制备雄性SD大鼠，体质量～g，先用戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉，再以0.13mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝从腹主动脉取血，血液置于离心机内r/min离心10min，小心吸取上清液置于洁净的5mLEP管内，剩余血液重复操作1次，小心吸取上清液置于前述EP管内，得到富血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）；剩余血液r/min离心15min，小心吸取上清液置于另一支5mLEP管内，得到乏血小板血浆（platelet-poorplasma，PPP），备用。
2.1.2诱导剂的制备精密称取12.8mg二磷酸腺苷（ADP）于5mL量瓶中，加入生理盐水定容至刻度，轻轻摇晃直到完全溶解，作为诱导剂储备液。吸取适量储备液用生理盐水按照1∶9稀释储备液，作为诱导剂工作液。
2.1.3对照品溶液制备精密称取1g阿魏酸钠于10mL量瓶中，加入5%DMSO去离子水溶液，超声溶解，制成对照品储备液，按剂间距1∶0.8稀释成80.0、64.0、51.2、40.7、32.6、26.0mg/mL6个质量浓度的对照品溶液。
2.1.4小金丸供试品溶液的制备精密称取小金丸粉末3g，置于具塞锥形瓶中，精密加入40%甲醇70mL，超声提取40min，滤过，滤渣提取第2次，合并滤液，减压回收溶剂得浓缩液，浓缩液进行冷冻干燥得到小金丸提取物，备用。准确称取各批次小金丸的冷冻干燥提取物适量，加5%DMSO去离子水溶液，超声溶解，制成小金丸供试品储备液，并按剂间距1∶0.8分别稀释成80.0、64.0、51.2、40.7、32.6、26.0mg/mL6个质量浓度的供试品溶液。
2.1.5血小板聚集率的测定血小板聚集仪提前开机预热30min至37℃后，仪器调零；在测试杯中加入PRPμL和样品25μL混匀，加入磁珠，预热3min，加入ADP诱导剂25μL，分别测定对照品（standard）和小金丸供试品（sample）的血小板最大聚集率，平行测定2次。
2.1.6相对效价计算方法抑制率（I）＝(空白血浆的最大聚集率－样品的最大聚集率)/空白血浆的最大聚集率。
参照《药品生物检定》[10]简化概率单位法的原理计算相对效价。实验中设定阿魏酸钠对照品的活血效价为1U/mg，将供试品测试质量浓度和相应的抑制率输入生物效价质反应计算软件，计算不同厂家、不同批次小金丸样品的生物效价和效价的可信限率（FL，%），并进行可靠性检验。
2.2小金丸组方原料药抗血小板聚集活性测定
参照“2.1.4”项下小金丸供试品溶液的制备方法制备小金丸供试品溶液，质量浓度为mg/mL。并按小金丸组方比例，分别称取药材粉末人工麝香0.09g、木鳖子0.45g、制草乌0.45g、枫香脂0.45g、醋乳香0.21g、醋没药0.21g、五灵脂0.45g、酒当归0.21g、地龙0.45g、京墨0.03g置于具塞锥形瓶中，按照小金丸提取方法制备10味小金丸原料药物供试品溶液，进行抗血小板聚集活性的测定，平行测定3次。
2.3统计学方法
应用SPSS21.0软件对数据进行处理，计量资料以表示，采用t检验进行两两比较，多组比较采用方差分析。
3结果
3.1DMSO的体积分数对血小板聚集的影响
在制备对照品溶液和供试品溶液时加入了助溶剂DMSO，而DMSO具有抗血小板聚集的作用[11]。因此，本研究考察了加入0%（空白组）、5%、15%、25%DMSO供试液的血小板聚集率，平行测定3次。对组间聚集率进行单因素ANVON方差分析，结果见表2。结果表明，5%DMSO组与空白组之间无显著性差异，15%DMSO组与空白组之间有显著性差异（P＜0.05），25%DMSO组与空白组之间存在极显著性差异（P＜0.01）。表明DMSO的体积分数影响血小板聚集。故本研究采用5%DMSO。
3.2小金丸提取溶剂的选择
不同溶剂提取出的小金丸提取物的抗血小板聚集作用强度不同，为了最有效的反映小金丸抗血小板聚集活性，本研究比较了不同体积分数甲醇的提取效果。小金丸分别以80%甲醇、40%甲醇和水为溶剂，超声提取，测定其对血小板聚集的抑制率，结果见表3。结果表明，小金丸40%甲醇提取物对血小板聚集的抑制率最强，为（85.23±2.00）%，故本研究选择40%甲醇为小金丸样品的提取溶剂。
3.3生物效价测定方法学考察
3.3.1精密度考察取同一份小金丸供试品（C17）溶液，按“2.1.5”项下方法连续测定6次，计算活血效价。结果显示小金丸的活血效价平均值为1.U/mg，RSD为3.29%，表明仪器的精密度较好。
3.3.2重复性考察取同一批小金丸（C17）约0.05g，平行6份，精密称定，制成供试品溶液，按“2.1.5”项下方法测定，计算活血效价。结果显示，6份小金丸（C17）的活血效价平均值为1.U/mg，RSD为4.83%，表明重复性较好。
3.3.3中间精密度考察实验室2名不同实验人员在2个不同时间段内，分别按“2.1.5”项下方法重复测定C19小金丸样品3次，计算活血效价平均值为1.U/mg，RSD为3.71%，说明不同实验人员对测定结果影响较小。
3.3.4可靠性检验可靠性结果表明，回归项有非常显著意义（P＜0.01），说明随着小金丸测试剂量的增加，小金丸对血小板聚集的抑制率有规律地增加，即量-效呈直线线性关系。偏离直线和偏离平行不显著（P＞0.05），说明供试品和对照品呈平行直线关系。说明本方法可靠性检验的结果成立，可用于定量测定小金丸的抗血小板聚集活性。
3.4小金丸及其组方原料药的活血效价测定结果
测定含有不同质量浓度小金丸供试品（C17）在ADP诱导下的血小板聚集率，典型的血小板聚集率波形图见图1。
测定30批次小金丸的血小板最大聚集率，计算活血效价，结果见表4。结果表明，30批次小金丸的血小板聚集生物效价在0.～1.U/mg，最大相差2.2倍，其中D厂家的活血效价整体较低（0.～0.U/mg）。同一厂家不同批次之间的小金丸活血功效也有一定差异，A厂家8批小金丸中，最高效价为1.U/mg，最低效价为0.U/mg；C厂家9批小金丸中，最高效价为1.U/mg，最低效价为0.U/mg。目前市售小金丸活血效价存在差异，提示其质量一致性有待提升。
测定小金丸组方10味原料药物的血小板最大聚集率，计算抑制率，重复3次，结果见表5。结果表明，单味药物地龙、五灵脂和木鳖子在小金丸方中具有较强的抑制血小板聚集作用，提示在小金丸发挥活血化瘀功效过程中，地龙、五灵脂和木鳖子起到关键性作用。
4讨论
小金丸组方中有多种常用活血化瘀类中药，活血化瘀是其主要功效之一。现代研究表明，血栓的形成与血小板聚集有直接关系[12]，抗血小板聚集能够从一定程度上反映小金丸活血化瘀的功效。比浊法作为一种体外评价血小板聚集功能的检测方法，在临床检验中被认可为检测血小板聚集作用的标准指南[13-15]。本研究基于小金丸活血化瘀功效，以血小板最大聚集率为评价指标，用阿魏酸钠作为标准对照物质，结合质反应计算软件定量计算活血效价值，并通过优化小金丸的提取方法，建立了定量测定小金丸抗血小板聚集活性的方法，为小金丸结合临床功效的质量控制提供了有效的分析手段和科学依据。
对照品的选择是中药生物活性测定法的重要问题之一。由于目前尚无用于生物效价研究的对照品，临床上ADP受体拮抗剂的代表药物有噻氯吡啶和氯比格雷，但它们都是前体药物，在体外不具有抗ADP诱导血小板聚集的活性[16]。阿魏酸是小金丸的有效成分之一；阿魏酸及其相应的盐阿魏酸钠均具有体内、外抗ADP诱导血小板聚集的作用[15-19]，而阿魏酸钠在水中的溶解度较好。故本实验选择阿魏酸钠作为参照物质，标定小金丸的抗血小板聚集活性。理论上，实验方法学考察的变异系数越小越好，但是生物效价检测方法存在一定的因生物个体差异而引起的误差，在准确度、精密度和可重复性方面与化学分析方法存在差距[20-21]。本实验精密度、重复性、中间精密度的RSD值均小于5%，在生物活性测定法中属于合理范围。
本研究通过比较30批不同厂家、不同批次市售小金丸的抗血小板聚集效价，客观地揭示了市售小金丸的质量差异。并通过处方分析，筛选出小金丸组方中发挥活血作用的关键药味，提示各厂家在投料时，要加强地龙、五灵脂和木鳖子饮片的质量监控，严格执行相关质量标准，从生产源头进行药品质量控制。地龙和五灵脂作为传统中药，均具有活血化瘀功效。现代药理研究表明，地龙具有较好的抗凝血、抗肿瘤、调节免疫、降压和抗心律失常等作用[22]；五灵脂具有较强的抗炎、活血化瘀和抗溃疡等作用[23]。木鳖子是一味传统的有小毒中药，具有消肿散结、攻毒疗疮功效，在方中用量较大。现代研究表明，木鳖子具有抗癌、抗炎、抗菌等药理作用，但木鳖子的活血化瘀作用尚未见报道，有文献报道其水提物及醇提物均含有一定的毒性，主要有毒成分是木鳖子素和木鳖子皂苷类[24]，本实验中木鳖子表现出较强体外抗血小板聚集作用是否与其毒性物质产生的细胞毒作用有关还需要进一步研究。
小金丸中其他传统活血药味在本实验中并未显示出抗血小板聚集活性，主要原因可能是它们在小金丸处方中所占比例小，有效成分含量较低，未达到起效浓度。如人工麝香对大鼠体内血小板聚集有抑制效应[25]，而其在小金丸处方中用量不到3%，本实验通过其在小金丸处方中的比例计算得到较低实验剂量，导致其未能表现出抗血小板聚集效应；当归在体外抗血小板聚集实验中，质量浓度在mg/mL时其血小板抑制率未达到50%[26]，本实验小金丸中当归的质量浓度只有7.70mg/mL，故很难显示出抗血小板聚集活性。
生物活性评价方法既能关联临床功效，又具有实际可操作性，在中药的质量评控中具有独特的优势。本研究首次采用关联临床功效的生物效价检测方法应用于小金丸的质量评价，不仅补充了小金丸的质量控制方法，也可以更加直观看到小金丸的抗血小板聚集效应，保证其临床使用的有效性和一致性。
参考文献（略）
来源：曹波，慈志敏，许润春，冯碧，许洪，杜晓娟，张定堃，张海珠，韩丽.基于抗血小板聚集效价的小金丸质量评价研究[J].中草药,,51（5）:-.
